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哪些因素影响了高保真DNA聚合酶的保真度?

更新时间:2020-10-22      点击次数:2020
     高保真DNA聚合酶的保真度是指准确复制目的模板的结果。具体来说,这涉及到多个步骤,包括读取模板链,选择正确的三磷酸核苷,并将此核苷酸插入3’引物末端的能力。为了区分正确和错误的核苷酸,一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。这种“校正”活性可切除不正确掺入的单核苷酸,并将其替换成正确的核苷酸。高保真PCR使用掺入错误率低且具有校正活性的DNA聚合酶,以保证目的DNA的忠实复制。
  在设计PCR实验时,你首先要考虑你的应用是否需要高保真聚合酶。如果实验结果依赖于正确的DNA序列(如克隆或测序),那么你就要尽量减少错配核苷酸的掺入。而对于普通PCR或菌落PCR,确定扩增子是否存在或质粒上是否带有插入片段,那高保真则大可不必。由于某些高保真聚合酶的强劲特性,一些研究人员在所有扩增中都使用它们。
  关于DNA聚合酶的高保真,目前还没有统一的定义。人们往往与TaqDNA聚合酶比较,来判断保真度的相对高低。例如,NEB(NewEnglandBiolabs)的科学家测定Taq聚合酶的错误率为2.7x10-4±0.8x10-4,或每3700个碱基1个错误。这些数据表明,利用Taq以25个PCR循环扩增400bp的片段,可能一半的克隆都带有错误。对于较大的片段如1kb,每个克隆都可能带有不想要的突变。相比之下,NEB的Q5超保真聚合酶的错误率比Taq低100倍。根据这一数据,200个克隆中的199个将是正确的。
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