琼脂糖凝胶与核酸电泳小知识分享
更新时间:2023-03-20 点击次数:1439
影响核酸电泳迁移率的几个因素
1、核酸分子大小
在一定浓度的琼脂糖凝胶中,DNA片段迁移距离和其含有的碱基对数量成反比,因此可以通过与标准条带迁移距离进行比较,由此得出目的条带的大小,但这仅对双链线性的DNA比较准确(DNA Marker一般为双链线状DNA),且对大于20kb的DNA不适用(普通琼脂糖凝胶很难将其分开)。
2、核酸分子构象
DNA分子在电场中的迁移速度不仅和分子量有关,还和它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的移动速度不一样,移动速度次序为:共价闭环DNA>线性DNA>开环DNA。当琼脂糖浓度太大时,环状的DNA一般不能进入胶内(停留在孔中)。
3、琼脂糖浓度
同样的线状DNA分子在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同,DNA电泳迁移率的对数和琼脂糖凝胶浓度呈线性关系,凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围
凝胶浓度(%) 线性DNA长度(bp)
0.5 1000~30000
0.7 800~12000
1.0 500~10000
1.2 400~7000
1.5 200~3000
2.0 50~2000
4、电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率和所加电压成正比。但电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分离率达到最大,所使用的电压不得超过5V/cm。
5、电泳方式
用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。垂直型电泳,一般用聚丙烯酰胺凝胶做为支撑物。水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。目前更多用的是后者,因为它制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根需要制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。
6、嵌入染料的存在
常用的荧光染料EB可以嵌入到堆积的碱基对之间,使其刚性更强,并使其迁移速率有所下降。
7、电泳缓冲液的离子强度
电泳缓冲液的组成和离子强度也能影响DNA的迁移速度。在离子存在很少的情况下(如无用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动;在高离子强度的缓冲液中(如误用10×电泳缓冲液),则电导率很高并产热明显,严重时能引起凝胶融化或DNA变性。