高保真DNA聚合酶的使用方案

由于不具有 3'-5'外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。还具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链 3'加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3'突出的单A核苷酸尾。另一方面，在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3'端加入单T核苷酸尾，产生 3'端突出的单 T 核苷酸尾。应用这一特性，可实现 PCR 产物的 T-A 克隆法。适用于，普通PCR，TA 克隆 Super Taq DNA 聚合酶 Super Taq DNA 聚合酶是由耐热的 Taq DNA 聚合酶和具有 3’-5’外切酶活性的高保真 DNA 聚合酶按照合适的比例混合而成，具有扩增效率高和错配率低的优良性能，使用该 产品扩增得到的 PCR 产物的 3’末端附有一个“A”碱基，可直接用于 TA 克隆。

  高保真DNA聚合酶产品描述，本酶为Pyrococcus furiosus中分离的pfu DNA pol基因在大肠杆菌中进行表达后经多步纯化分离而得。Pfu DNA聚合酶具有3′→5′外 切酶(校正)活性，当聚合反应发生碱基错配时，聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。Pfu DNA聚合酶为使用范围广的高保真DNA聚合酶，其错误率仅为1.3x10-6，推荐Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反应。产品用途，用于要求保真度比较高的PCR反应，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成，DNA片段的补平等（参见实验方案）。使用建议：Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端，无3′端"A"突出，其PCR产 物的克隆有几种方案。

  高保真DNA聚合酶主要特性，此酶早在大肠杆菌中发现，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。这类酶的共同性质是，以脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA。需要模板和引物的存在。不能起始合成新的DNA链。催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端。催化DNA合成的方向是5'→3'。PCR前引物进行5′端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆 于平滑末端的载体中（参见实验方案）引物中引入15bp与载体同源序列，利用 PCR产物一步定向无缝克隆试剂盒（Cat# NR001）直接连接到目的载体。pfu DNA聚合酶由于Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3′端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度，理想的引物长度为20-30碱基。另外为了减少由3′→5′外切酶活性引起的引物降解，尽量在冰上配制反应体系，并后加入Pfu酶。