注意!使用ecL化学发光液一定要明白这几点

    取A液和B液一定要用不同的枪头，工作液现配现用，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜*干燥。用移液器将工作液加到膜上（推荐150μl发光液/cm2膜），使之充分接触。室温孵育5分钟，准备立即压片曝光。用平头镊子夹起膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体，留下少量工作液，不可让膜*干燥。

    在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来*包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白条带面向上。在黑暗中将X感光胶片放置在包裹的保鲜膜上，根据蛋白浓度曝光适当时间（根据光强度需摸索曝光时间，一般30s-2min），显影冲洗。注：根据经验，如果背景过高，可使用两张X感光胶片同时压片。

    ecL化学发光液的注意事项，步骤1～5可在日光灯下操作；但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光，因而弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。由于超敏发光液极其灵敏，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败。某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可确定胶片上条带的位置和大小。NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗体应避免使用NaN3，如必需使用勿超过0.01%。