免疫印迹法(WB)、免疫组化(IHC)和酶联免疫吸附实验(ELISA)，是免疫学常用工具，主要应用于蛋白的定位、定性和定量。
其中 WB实验是先通过进行跑电泳后，然后将分离好的蛋白质样品转移到固相载体上，再利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，常用于定性和半定量。
图｜ WB实验流程图
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WB实验常见十问
1、细胞水平做WB，一般多少数量细胞提的蛋白够做WB？做组织样品的WB的时候,怎样处理样品？
答：一般5×10^6就足够了；特殊情况需根据自己的研究来确定。
必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(12000转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
2、蛋白变性后可以存放多久？
答：-80℃，若没有反复取出冻融，保存一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
3、同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品；有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。
4、上样超载多少会对实验有影响？可以用什么方法来增加上样量？
答：正常超载30％不会有问题的，但不建议超载加样。
可以浓缩样品，或者根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白，还可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，比如尝试1.5mm厚的胶。
5、我所测定的蛋白分子量是100KD左右，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意不同浓度目的条带位置肯定会发生一定地偏移。具体参照如下图(李记有3款预混胶、预制胶，详情请参考“关于蛋白电泳那些事")
6、一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
答：WB一般上样30-100μg不等，结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
最开始摸条件时，各个步骤都可以量多一点时间长一点(背景也容易就出来了)。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复测试。
7、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？
答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持冰浴，保持低温。除非有文献特别指明必须使用特殊方法，一般来说没有区别。
8、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜表现不是很好？
答：这是正常的，大分子的蛋白转移很慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡(转过的表现)。注意一点：丽春红染色较好，不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准，只能作为一个粗略参考。
9、做半定量WB，内参β-actin，GAPDH哪个好？
答：一般选用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代谢这方面的研究还是尽量选择β-actin。
10、请问一下PVDF膜和NC膜的区别是什么？为什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，有疏水作用但相对较弱，和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
硝酸纤维素膜(NC膜)是通过疏水作用来和蛋白质相联，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。
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