双荧光素酶报告基因检测试剂盒

      萤火虫荧光素酶是一种分子量约为61 kD 的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的过程中，会发出生物荧光(Bioluminescence)。海肾荧光素酶是一种分子量约为36 kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的过程中也会发出生物荧光。生物荧光可以通过化学发光仪(Luminometer)或液闪测定仪进行测定。

　　在 DLR 检测中，萤火虫（Firefly）荧光素酶和海肾（Renilla）荧光素酶的活性可在单个样品中依次检测。先是先以荧光素(Luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)，后以肠腔素(Coelenterazine)为底物来检测海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)，并在后续加入海肾荧光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化Luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾荧光素酶的活性，实现双荧光素酶报告基因检测。通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5' 启动子区克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 区克隆在Luciferase 的下游等，构建成报告基因(Reporter Gene)质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。 Renilla Luciferase 相对更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。

　　具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广，无细胞内源活性干扰等特点。

订购信息

试剂盒组分

保存方法

蓝冰运输。-20℃保存，有效期12个月。

【注】：C组分建议预先使用B组分配制为2 mg/mL储液，B组分、D组分及配制为储液的C组分，根据实验需求进行小批量分装。所有检测工作液建议现配现用，避免反复冻融。

使用方法
1.细胞裂解
（1）将转入报告基因的细胞中的培养基移除，加PBS 轻轻洗涤两次（贴壁细胞可直接进行此操作，悬浮细胞要离心收集细胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer (用无菌水按 4:1 稀             释 A 组分)， 然后将培养板放在微型震荡器上室温震荡 15 min，充分裂解细胞。

 注：裂解产物可室温保存 6 h，-70℃可长期存放（裂解产物不能多次反复冻融）。如果荧光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以小为  100μL。

（2）将充分裂解后的裂解产物，10000-15000 rpm 离心 3-5 min。离心后将上清液移入新的 EP 管中进行后续检测。

（3）细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。

2. 工作液配制

（1）用B 组分充分溶解C 组分，配制成0.2 mg/mL的萤火虫荧光素酶检测液。

注：萤火虫荧光素酶工作液不能反复冻融，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格。

（2）用D组分将E组分稀释成1× Coelenterazine工作液，稀释方法为将1 µL E组分加入到49 µL D组分中，此稀释方法可按比例相应扩大。

注：1× Coelenterazine工作液应该现用现配。
3. 化学发光值检测

（1）将上述配制好的萤火虫荧光素检测液和1× Coelenterazine工作液恢复至室温。

（2）按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为2 s，测定时间设为10 s。

（3）每个样品测定时，取样品20-100μL(如果样品量足够，请加入100μL；如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量宜保持一致)。

（4）加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。

注：由于该发光为瞬时发光，建议加入萤火虫荧光素酶检测试剂后，立即进行发光值的检测。

（5）在完成上述测定萤火虫荧光素酶步骤后，加入 100 μL海肾荧光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。

（6）在以海肾荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的 RLU 值除以海肾荧光素酶测定得到的 RLU 值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫荧光素酶为内参，也可以进行类似计算。

注意事项
1. 为取得理想测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入萤火虫荧光素酶检测试剂。

2. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。