JC-1线粒体膜电位检测试剂盒

产品描述
　　线粒体膜电位降低是细胞早期凋亡的一个标志，它发生在细胞膜上的磷酯酰丝*酸外翻与caspase水解酶激活之前。当线粒体膜通透性发生改变时，膜电位会降低。这种膜电位的改变是由于 Bax二聚体的形成和 Bid, Bak, Bad的激活，从而诱导线粒体膜形成孔隙造成的。当这些促凋亡蛋白被激活时，线粒体同时也将细胞se su C 释放到细胞质中。
　　JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位△ Ψm的理想荧光探针，它可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时 JC-1 为单体，可以产生绿色荧光。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到膜电位的下降，同时也可以用 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
　　JC-1单体的大激发波长为 510 nm，大发射波长为527 nm；JC-1 聚合物的大激发波长为 585 nm，大发射波长为 590 nm。操作简单快速，可以通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪检测。
订购信息

产品组分

保存方法
　　组分A、B需4℃避光冷藏，并尽量避免反复冻融，组分C﹣20℃保存。有效期见外包装。
光谱特性
Ex/Em：
510/527 nm（单体物，绿色）；
585/590 nm（聚合物，红色）。
操作步骤
1.试剂准备：
配制 JC-1 工作液
按如下方案配置1mL 1×JC-1染色工作液：取10 µL 100×JC-1染色液，加入到890 µL灭菌的diH2O中，涡旋混匀，向上述混合液中加入100 µL 10× Assay Buffer，涡旋混匀，即可得到1×JC-1染色液。
【注】：
（1）配置体积可同比例扩大或缩小。
（2）不建议直接用1×Assay Buffer稀释100×JC-1染色液，可能会出现沉淀。
配制1× Assay Buffer
用 diH2O 按 10：1 稀释检测缓冲液（如1 mL 10×assay buffer + 9 mL diH2O）。
2.流式细胞染色方案：
细胞染色
开始实验之前，请确保JC-1和CCCP溶液已恢复至室温。
（1）按实验所需，在培养板中接种细胞（悬浮细胞不要超过106个/mL）。
（2）阳性对照组：根据培养基的量加入相应体积50 mM的CCCP溶液（如终浓度为50 μM即1 mL培养基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
（3）对于贴壁细胞，染色前先进行消化处理，将其制成细胞悬液，0.5 mL装于离心管中。
（4）室温下400 x g，离心5 min。
（5）除去上清。
（6）用0.5 mL的 JC-1 工作液重悬细胞。
（7）置于37℃细胞培养箱，孵育 15 min。
（8）室温下400 x g，离心 5 min，去除上清。
（9）用 2 mL 的 PBS 缓冲液、培养基或1× Assay Buffer重悬细胞，离心去除上清，重复一次。
（10）用 0.5 mL的 PBS 、培养基或1× Assay Buffer重悬细胞，用流式细胞仪检测分析。
流式细胞仪定量分析
对于正常细胞，在PE或PI（FL2）通道可以检测到线粒体内的JC-1红色聚集物；对于凋亡细胞，在FITC（FL1）通道可以检测到JC-1绿色单体物。
3.荧光显微镜染色方案：
悬浮细胞染色
（1）参照流式细胞仪染色方案，对细胞进行染色。
（2）用0.3 mL的 PBS或培养基重悬细胞。
贴壁细胞染色
（1）在培养皿或培养板上接种细胞。
（2）阳性对照组：根据培养基的量加入相应体积50 mM的CCCP溶液（如终浓度为50 μM即1 mL培养基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
（3）去除培养基，加入JC-1工作液使其覆盖细胞表面。
（4）置于37℃细胞培养箱，孵育 15 min。  
（5）除去染液，用PBS 缓冲液、培养基或1× Assay Buffer清洗一次细胞。
（6）用荧光显微镜观察分析。
荧光显微镜成像
采用可以同时检测荧光素和罗丹明，或者荧光素与Texas Red 的双通道滤波器荧光显微镜观察细胞。对于正常细胞，拥有完整的线粒体膜电位，线粒体在590 nm处发出红色荧光，细胞质发出绿色荧光；对于凋亡或坏死的细胞，染料以单体形式存在，在530 nm处发出绿色荧光。
4.测定荧光相对比率染色方案：
（1）按照实验要求在96孔板中接种细胞。
（2）阳性对照组：根据培养基的量加入相应体积50 mM的CCCP溶液（如终浓度为50 μM即1 mL培养基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
（3）根据荧光显微镜细胞染色方案对细胞进行染色处理。
（4）用荧光酶标仪检测荧光值（红色荧光：Ex/Em=550/600 nm；绿色荧光 Ex/Em=485/535 nm）。
（5）计算红绿荧光比值。
（6）与正常细胞相比，在凋亡或坏死细胞中，红绿荧光比值会降低。
注意事项
　　该产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。