人外周血淋巴细胞分离液

产品描述

外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等细胞，其密度为 1.075g/ml~1.090g/ml ，粒细胞和红细胞密度较大，为 1.090g/ml，血小板密度为 1.030g/ml~1.035g/ml。经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞分离。

人外周血淋巴细胞分离液通过密度分离作用，用于样本中不同成分的分离，以便于对样本的进一步分析。本产品由泛影酸、氢**钠、羟**淀粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、注射用水组成。

订购信息

运输与保存

常温运输。常温避光保存，有效期24个月。

使用方法

实验前准备

1. 适用仪器：最大离心力可达1200g 的水平转子离心机。

2. 抗凝剂的选择

在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验（或必须使用枸橼酸钠的医用真空抗凝采血管）。

由于血浆中的纤维蛋白原活化成有活性的纤维蛋白，纤维蛋白交联成纤维蛋白血凝块，易使PBMC 形成细胞团块，不利于细胞的活化。肝素钠抗凝剂可减轻上述情况发生几率。分离出的PBMC 无需培养，而是用于其他检测：选择枸橼酸钠抗凝剂，分离效果好。

3. PBMC 最佳分离时间：血液离体后2h内。如达不到2h内分血条件，请务必于4h内进行分血步骤，超过4h很难顺利进行分离。

4. 分离液的使用环境

a. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在18℃-22℃环境温度下进行操作，20℃条件下分离效果好。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。

5. PBMC 高效离心管

6. 参考值（目的细胞参考范围）

本试剂可保证目的细胞的提取率大于80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞，请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

检验方法

全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃（试剂需要复温，夏季20℃，冬季23℃）的条件下进行。血液样本需要稀释时，实验方法如下：稀释方法：1 份的PBS 或样本稀释液加2 份的血液进行稀释（PBS:抗凝血＝1:2）【注】：稀释液要求：用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。

各种规格离心管的使用方法（推荐最佳方法）：取一支无菌离心管，加入分离液，然后缓慢加入血液样本或新鲜抗凝血。血液样本或新鲜抗凝血小心加于分离液液界面之上。（若采血量较少，需小量分离，分离液的量不得少于3ml，抗凝血量在0.2-3ml 之间）

1.     15ml 离心管（包括高效离心管）：

1.A. 最佳比例：5ml 分离液+ 4ml 稀释过的血液；

1.B. 最佳离心条件：20℃环境下，500g 离心25min。

2.     50ml 离心管（包括高效离心管）：

2.A. 最佳比例：20ml 分离液+ 20ml 稀释过的血液；

2.B. 最佳离心条件：20℃环境下，650g 离心30min。

未经稀释的抗凝血分离方法（细胞培养、或需保存血浆推荐用此方法）：

3.     使用15ml 离心管（或15ml 高效离心管）：

3.A. 15ml 普通离心管最佳比例：5ml 分离液+ 5ml 抗凝血；

3.B. 15ml 高效离心管最佳比例：4ml 分离液+ 5ml 抗凝血；

3.C. 最佳离心条件：20℃环境下，600g 离心25min。

3.【注】：获得纯度较高的血浆：离心后，吸取血浆层由上至下的2/3 处血浆，下1/3 处血浆可能包含部分PBMC 及少量分离液成分；

3.

4.     使用50ml 离心管（或50ml 高效离心管）：

A. 50ml 普通离心管最佳比例：20ml 分离液+ 20ml 抗凝血；

B. 50ml 高效离心管最佳比例：15ml 分离液+ 20ml 抗凝血；

C. 最佳离心条件：20℃环境下，600g 离心30min。

【注】：获得纯度较高的血浆：离心后，吸取血浆层由上至下的2/3 处血浆，下1/3 处血浆可能包含部分PBMC 及少量分离液成分。

实验后续方案（以血液样本5ml为例）

1.     离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色（人）淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

2.     ①小心吸取血浆层转移到新离心管A 中。

2.②小心吸取离心管中的环状乳白色（人）淋巴细胞层转移到新离心管B 中。

3.     向含有（人）淋巴细胞的离心管B 中，加入5-10ml 清洗液，混匀细胞。

4.     350-450g，离心10min。弃去上清。

5.     用吸管吸取5ml 清洗液重悬所得细胞。

6.     350-450g，离心10min，弃去上清。

7.     重复清洗两次，弃去上清，用0.5ml 清洗液或根据下一步实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

7.

分离过程中可能出现的情况及处理方案

情况一：淋巴细胞层混杂红细胞

1. 吸取有红细胞混杂的淋巴细胞层。

2. 取15 毫升离心管加入红细胞混杂的淋巴细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入5-8 倍

红细胞裂解液。

a. 如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液（产品编号：AP01L106  需另购）将红细胞

裂解（具体方法见“红细胞裂解液使用说明"）即得目的细胞。

b. 参考红细胞裂解液说明书操作。少时多次裂解后获得淋巴细胞。

注意事项

1.     本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.     本试验要求，在正常大气压下，样本、分离液及分离环境温度为 20℃±2℃,否则会影响产品质量。

3.     本产品不得使用紫外线消毒，如出现浑浊、沉淀、絮状物、包装破损或漏液不得使用。

4.     关于血液分离液效果：

4.A. 脐带血：脐带血收集到细胞分离时长一般大于2 小时，冷藏存放与运输在所难免。与外周血静脉采血相比，大多脐带血分离效果较差。

4.B. 案例：应用过免疫动员剂类药物，普通的样本密度分离液分离效果较差，有大量的粒细胞混杂，不能使用。

5.     本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。

6.     吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。

7.     吸取过多的淋巴细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。

8.     不当的稀释方法会降低细胞得率及活性。稀释液要求：不含钙镁离子的缓冲液或培养基。血液样本经过稀释则分离过程中需适当降低离心力和离心时间。

9.     如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持。

9.

10.  参考值（参考范围）

本实验淋巴细胞提取率大于80%。下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，可适当进行参考。

11.  可能存在的问题及解决方法

由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

12.  离心力公式及单位换算

13.  本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。

14.  本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不*全的情况，可以适当加大离心转速。【注】：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以50-100g 为基数，直至达到最佳分离效果，离心力最小不得小于400g，最大不得大于1200g。离心时间以20-30min 为准。

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