Annexin V-FITC/PI流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用

更新时间：2026-01-21

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　　细胞凋亡（Apoptosis）是维持多细胞生物发育、稳态及免疫平衡的重要程序性死亡过程，其异常调控与肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫病等密切相关。因此，准确检测细胞凋亡是生命科学研究和临床转化中的关键需求。在众多检测方法中，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术因高灵敏度、多参数分析及可定量等特点，成为细胞凋亡研究中常用的技术之一。本文将从原理、实验设计及应用领域等方面，系统阐述该技术的核心价值。

　　一、技术原理：基于磷脂酰丝氨酸（PS）的膜不对称性变化

　　细胞凋亡早期的核心特征之一是细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）向外侧翻转，暴露于细胞外环境。Annexin V是一种高度特异性的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有强亲和力，因此可通过标记荧光素FITC（异硫氰酸荧光素）的Annexin V（Annexin V-FITC）与暴露的PS结合，直接反映细胞凋亡早期状态。

　　而碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种不能透过完整细胞膜的DNA染料，仅能进入膜受损的晚期凋亡或坏死细胞，与核内DNA结合后发出红色荧光。通过同时检测Annexin V-FITC（绿色）和PI（红色）的荧光信号，可将细胞群体分为四类：

　　•Annexin V⁻/PI⁻：活细胞（无PS暴露，膜完整）；

　　•Annexin V⁺/PI⁻：早期凋亡细胞（PS暴露但膜未破裂）；

　　•Annexin V⁺/PI⁺：晚期凋亡/坏死细胞（PS暴露且膜损伤）；

　　•Annexin V⁻/PI⁺：机械损伤或坏死细胞（膜严重破坏，无PS特异性暴露）。

　　二、实验设计与操作要点

　　为确保检测结果的准确性，需严格优化以下环节：

　　1.样本处理：细胞需经轻柔消化（如胰酶-EDTA）避免机械损伤，收集后PBS洗涤去除血清（含蛋白质可能干扰Annexin V结合），调整细胞密度至1×10⁶/mL。

　　2.染色条件：按说明书比例加入Annexin V-FITC和PI（通常终浓度分别为5μL/10⁶细胞和10μL/10⁶细胞），避光孵育15-20分钟（室温或4℃），避免时间过长导致假阳性。

　　3.上机检测：使用流式细胞仪（如BD FACSCalibur）设置FITC通道（Ex/Em=488/530 nm）和PI通道（Ex/Em=488/620 nm），每管至少检测1×10⁴个细胞，同时设未染色、单染（仅Annexin V或仅PI）对照以调节补偿。

　　三、核心应用领域

　　1.基础研究中凋亡通路的解析

　　在药物研发中，Annexin V-FITC/PI可快速评估化合物对肿瘤细胞的促凋亡作用。例如，研究顺铂对肺癌A549细胞的影响时，通过双染发现24小时即可诱导约30%细胞进入早期凋亡（Annexin V⁺/PI⁻），48小时晚期凋亡比例升至50%，为确定药物作用时间窗提供依据。此外，结合Caspase抑制剂（如Z-VAD-FMK）可验证凋亡是否依赖Caspase级联反应，明确药物作用靶点。

　　2.疾病机制研究中的细胞命运追踪

　　在神经退行性疾病中，如阿尔茨海默病（AD）模型小鼠的海马神经元，通过Annexin V-FITC/PI检测可发现Aβ寡聚体处理后，凋亡细胞比例较对照组升高2倍，提示神经元丢失与凋亡密切相关。在自身免疫病中，如系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T细胞，双染显示其早期凋亡率显著低于健康人，可能与抗凋亡分子Bcl-2过表达相关，为发病机制提供直接证据。

　　3.临床治疗监测与疗效评估

　　在肿瘤化疗中，该技术的动态监测价值尤为突出。例如，对急性髓系白血病（AML）患者化疗前后的骨髓单个核细胞进行检测，若早期凋亡率从5%升至25%，提示化疗有效；反之，若晚期凋亡/坏死比例过高（>40%），则可能因药物毒性导致正常细胞大量死亡，需调整方案。此外，在CAR-T细胞治疗中，通过检测靶细胞（如CD19⁺B细胞）的凋亡率，可实时评估回输细胞的杀伤效果。

　　四、局限性与优化方向

　　尽管Annexin V-FITC/PI应用广泛，仍需注意其局限性：①无法区分早期凋亡与自噬（部分自噬细胞可能PS暴露）；②坏死细胞与晚期凋亡细胞表型重叠，需结合其他指标（如7-AAD、Caspase-3活性）进一步验证。未来，通过与线粒体膜电位探针（JC-1）、活性氧（ROS）检测等联用，可构建更全面的细胞死亡分析体系，推动精准医学发展。

　　Annexin V-FITC/PI流式细胞术凭借其操作简便、结果直观的优势，已成为细胞凋亡研究的标准工具。从基础机制探索到临床转化应用，该技术不仅深化了我们对细胞命运的理解决，更为疾病诊断与治疗提供了关键技术支撑。随着多色流式与单细胞测序等技术的发展，其在生命科学与医学领域的应用前景将更加广阔。