RIPA裂解液  (强)

产品描述

RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液，是一种经典的动物组织/细胞快速裂解液，通过组合离子型去垢剂和非离子去污剂对组织细胞的消化作用使组织细胞崩解释放出蛋白质，对细胞膜、胞浆亚组分、胞核成分均有较强裂解作用。适用于PAGE、Western Blotting和免疫沉淀(IP)的研究。

李记生物RIPA裂解液 (强) 不含PMSF组分；适用PAGE、Western Blotting和免疫沉淀(IP)的研究。

订购信息

运输与保存

常温运输。4℃保存，有效期12个月。

配方表

25mM Tris•HCl，150mM NaCl，1% NP-40，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，pH 7.6

使用方法

贴壁细胞

1.      取适量裂解液，加入蛋白酶抑制剂混合物(100×，不含EDTA) （货号:AP02L084） 或PMSF（终浓度为 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

2.      去除细胞培养液，用预冷的 PBS 洗涤两次。按照6孔板每孔加入150-200ul 的裂解液的比例均匀加入裂解液，如果细胞密度过高可增加裂解液的量至250-300 uL。【注】：裂解液过少会使细胞裂解不充分，影响蛋白提取的质量。

3.      用枪吹打数下，冰上放置10 min，期间每隔2 min用枪吹打数下。

4.      转移细胞裂解液于1.5 mL EP管中。

5.      12,000 g，4℃ 离心5min。

6.      收集上清。

悬浮细胞

1.      取适量裂解液，加入蛋白酶抑制剂混合物(100×，不含EDTA) （货号:AP02L084） 或PMSF(终浓度为 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

2.      收集细胞0.5~2x10⁷于1.5mL离心管中，1mL预冷的PBS洗涤两次，1,000xg 离心3 min，弃上清，重复三次。

3.      按照6孔板每孔加入150-200uL 的裂解液的比例均匀加入裂解液，如果细胞密度过高可增加裂解液的量至250-300uL。【注】：裂解液过少会使细胞裂解不充分，影响蛋白提取的质量。

4.      用枪吹打数下并剧烈震荡，冰上放置10 min，期间每隔2 min震荡一次。

5.      12,000 g，4℃ 离心5 min。

6.      收集上清。

组织样品

1.      把组织剪成细小的碎片。

2.      取适量裂解液，加入蛋白酶抑制剂混合物(100×，不含EDTA) （货号:AP02L084） 或PMSF(终浓度为 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

3.      按照每100mg组织加入1mL裂解液的比例加入裂解液（如裂解不充分可适当增加裂解液，如果需要增加蛋白浓度可适当减少使用的裂解液体积）。

4.      用匀浆器匀浆，直至充分裂解（为防止蛋白降解请于冰上操作）。

5.      12,000 g，4℃ 离心5 min。

6.      收集上清。

注意事项

1.         本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.         如需检测磷酸化蛋白，则需要额外添加磷酸酶抑制剂II cocktail（50×）(货号:AP03L025) 。

3.         RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

4.         RIPA裂解液（强）含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定蛋白。

5.         如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

6.         通常6孔板每孔细胞加入150 μL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200 μL或250 μL。

表1: RIPA裂解液的使用量

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