博莱霉素 (Zeocin)

产品描述

 Zeocin即phleomycin D1，中文名称博来霉素或者腐草霉素D1，是从轮状链霉菌(Streptomyces verticillus)的一个突变体菌株中分离而来的博来霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成员。它对细菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。

Zeocin是一种碱性、水溶性的、铜离子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Zeocin溶液呈现蓝色，无活性。当其进入细胞后，Zeocin上的Cu2+被还原为一价铜离子(Cu+)，并被细胞内的巯基化合物(sulfhydryl compound)清除，导致Zeocin被活化，能够结合到细胞内DNA上并使其断裂，最终导致细胞死亡。

对Zeocin产生抗性的蛋白是来源于印度链球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因编码一种14kDa大小的蛋白，它能够以一定比率结合Zeocin，使其不能结合细胞DNA，抑制其DNA断裂活性，从而使细胞对Zeocin产生抗性。因此，Zeocin可用来筛选表达Zeocin抗性基因的多克隆或单克隆细胞，或用于相应的多克隆或单克隆细胞的维持性培养。

Zeocin对于绝大多数好氧细胞均有效，常用于细菌(如大肠杆菌)、真核微生物(如酵母)及动植物细胞的筛选。大肠杆菌筛选推荐浓度为25~50μg/mL (低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)；酵母筛选推荐浓度为50~300ug/mL (YPD或基本培养基)；哺乳动物细胞筛选推荐浓度为50~1000ug/mL (合适培养基，根据细胞系的类型而不同)。实际应用时，应针对不同的细胞系测试Zeocin的浓度梯度，以确定最佳使用浓度。

订购信息

运输与保存

蓝冰运输。-20℃避光保存，有效期12个月。【注】：避免反复冻融。

技术参数

使用方法

1.细菌的筛选(以大肠杆菌为例)

(1)     使用不含Tn5转座子元件的宿主细胞如DH5、DH10等进行筛选。

(2)     需使用低盐LB培养基（10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母提取物，调整pH至7.5，加水定容至1L）以维持Zeocin的活性。

(3)     Zeocin筛选的推荐浓度为25~50μg/mL。

2.真菌的筛选(以酵母为例)

(1)     适用于酿酒酵母和毕赤酵母。

(2)     培养基的选择：含1M山梨醇的YPD培养基（适用于电穿孔法转染细胞）；YPD或基本培养基（适用于化学法转染细胞）。调整培养基pH至6.5~8.0，并选择使用低有效浓度的Zeocin进行筛选。

(3)     转染方法：需使用电穿孔或锂离子转染法。不要使用酵母原生质球(spheroplasting)进行Zeocin抗性的转染及筛选，因为Zeocin会导致原生质球的死亡。

(4)     Zeocin筛选的推荐浓度为50~300μg/mL。具体浓度与酵母菌株、培养基pH以及离子强度有关。

3.哺乳动物稳定表达细胞株的筛选

Zeocin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为50-1000μg/mL (平均常用浓度为250-400μg/mL)。影响筛选浓度的主要因素包括离子强度、细胞类型、细胞生长密度以及生长速率。根据细胞类型的不同，需要1-2周可以筛选到Zeocin抗性的细胞。在筛选稳定表达细胞株之前，需要先确定能够杀死未转染细胞的Zeocin最佳工作浓度。Zeocin的最佳工作浓度需要通过剂量效应曲线来确定。下表列出了部分细胞中Zeocin的筛选浓度范围以供参考。

表1.部分常见哺乳动物细胞的Zeocin推荐筛选浓度表

(1)   细胞对Zeocin敏感性的确定(杀灭曲线的建立)

①     接种细胞使得细胞密度约为25%，按照8、16或24个细胞培养孔(分别为单个培养孔、复孔和三复孔)准备培养的细胞，培养24h。

②     去除细胞培养液，换成含不同浓度Zeocin的新鲜筛选培养液(0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000μg/mL)。

③     每2-4 d更换新鲜的筛选培养液，观察存活细胞的比例，选择在1-2周内杀死所有细胞的低浓度作为最佳工作浓度。

(2)   筛选Zeocin抗性的稳定细胞株

①     按照20%-30%的细胞密度接种细胞，培养过夜。

②     转染携带Zeocin抗性基因的质粒或感染携带Zeocin抗性基因的病毒，同时设置没有转染质粒或感染病毒的细胞作为对照。说明:没有转染质粒或感染病毒的细胞，也需要同样进行转染质粒或感染病毒的相应实验操作。

③     转染或感染48-72 h后，换成含有最佳工作浓度的Zeocin (由步骤a中的杀灭曲线确定)的新鲜培养液，继续培养。如果有必要，可以对细胞进行传代，略稀释后进行筛选培养。

④     每2-4 d更换含有Zeocin的新鲜筛选培养液。

⑤     对照组正常细胞100%死亡，Zeocin抗性组中存活的细胞即为表达Zeocin抗性基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。根据细胞种类和转染/筛选效率，单克隆细胞株的形成可能需要一周或更多的时间。【注】：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，则按照以下方法克服此类耐受性：用含Zeocin培养液进行细胞接种培养，置于37℃孵育2-3 h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4℃，2 h。需要使用HEPES作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37℃孵育。4℃孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin能发挥作用，杀死细胞。

(3)   稳定细胞株的维持培养

可采取如下几种方式之一来维持培养稳定细胞株：

①     使用含有与上述筛选稳定转染细胞株相同浓度的Zeocin筛选培养液来维持培养。

②     降低Zeocin浓度为筛选浓度的一半进行维持培养。

③     使用刚好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin浓度来维持培养(根据杀灭曲线来判断)。

注意事项

1.       本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.       Zeocin人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3.       Zeocin对光敏感，需避光保存于-20℃。含有该抗生素的平板或培养基也需避光保存。

4.       高离子强度、酸或碱性都会抑制Zeocin的活性，该抗生素在过高或过低pH及弱氧化剂的条件下不稳定，且变性不可逆。在培养细菌时，需适当降低细菌培养基的盐浓度(低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)并调整pH至7.5，从而使其保持活性。

5.       抗生素不稳定，请在有效期内尽快使用。

6.       以上数据均来自公开文献，和元李记暂未对本产品进行独立验证，仅供参考。

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