EdU细胞增殖流式检测试剂盒

产品描述

细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)掺入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与荧光染料的特异性共轭反应，把荧光基团标记到新合成的含有EdU的DNA上面，这样可以进行高效快速的检测出DNA复制活性，此技术广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复等方面的研究。

传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法需要DNA变性、抗原修复、抗原抗体过夜孵育等复杂繁琐的操作步骤。而EdU检测方法不需要剧烈的DNA变性，只需温和的细胞固定化和透化处理，能够较好地保护细胞形态、DNA整体结构及细胞内抗原识别位点，操作步骤更加快速、灵敏和准确。EdU与胸腺嘧啶(T)结构非常相似，大小却只有BrdU抗体的1/500，很容易在细胞内扩散；无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更快速便捷地反映DNA复制活性。

订购信息

产品组分

运输与保存

蓝冰运输。-20℃保存，有效期12个月。

使用方法

本产品是采用成像检测方法对贴壁细胞进行检测，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜等仪器。非贴壁细胞可在孵育 EdU 后进行细胞涂片处理，固定后再采用贴壁细胞的染色流程进行检测。也可以应用于流式细胞仪检测。以24孔板，HK2贴壁细胞为例：

EdU标记

1.        将细胞完*培养基中按照 500:1的比例加入 EdU 溶液，制成 2xEdU 标记培养基。

2.        提前将 2xEdU 标记培养基预热然后等体积加入到细胞原有培养基中，获得1xEdU 溶液，其中 EdU 的终浓度为 10uM。【注】：（1）我们不建议替换全部培养基，因为这样可能会影响细胞增殖的速度；（2）配置好的培养基建议现用现配，用量以没过细胞为宜。

3.        每孔加入 300ul 含 EdU 培养基孵育细胞2h，弃培养基。【注】：（1）培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态；（2）大多数肿瘤细胞以及粘附细胞系均可采用2h的孵育时间。

4.        以 1xPBS 清洗细胞两次，每次5min以除去未掺入DNA的EdU残留。【注】：贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。

细胞的固定和通透

1.          每孔加入150ul 4%多聚甲醛细胞固定液，室温培养30min，弃固定液。

2.          每孔加入150ul 2mg/ml 甘氨酸，摇床孵育5min，以中和过量的多聚甲醛。

3.          弃甘氨酸溶液，每孔加入300μ1PBS洗液，室温清洗5min。

4.          每孔加入300ul 0.5% Triton X-100 细胞通透液，室温通透10min，弃细胞通透溶液。

5.          每孔加入 300ul PBS 洗液，室温清洗5min。

EDU染色

1.        通过用10：1去离子水稀释反应缓冲液，进行配制1×反应缓冲液。

2.        按照溶解 200 mg缓冲添加剂溶于1 mL去离子水的比例称取适量的粉末进行溶解，即为可用的缓冲添加剂的浓度，建议现用现配。【注】：缓冲添加剂为白色粉末，较难准确称量，称量范围可稍微放宽，但是不应超过±20%，且该粉末较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。

3.        按照以下的表格进行染色反应液的配制：

4.        每孔加入配置好的检测混合液，体积以覆盖细胞为宜，充分重悬细胞，避光、室温孵育10-30 min。

5.        弃染色反应液，加入300 ul 0.5% Triton X-100 细胞渗透液清洗 2-3 次，每次 10 min。

6.        弃细胞渗透液，用 PBS 洗两次，每次5 min。

DNA染色

1.        将Hoechst 33342 *超级纯*(货号：AC12L021)用PBS溶液1:1000进行稀释得到终浓度为 5ug/ml 的1×Hoechst染色液。

2.        每孔加入150ul 1×Hoechst染色液，室温避光孵育20-30 min后，弃染色液。

3.        每孔加入 300 ul PBS 洗细胞两次，去掉洗液。

其它染色（自备）

（可选）可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色。染色完的样品上机检测时，根据使用的染料选择合适的通道检测。

图像获取及分析

建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察;如果条件限制，请于4℃条件下避光湿润保存3天之内完成拍照。若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂进行封片后于 4°C条件下保存及拍照检测。

注意事项

1.      本产品科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。