外泌体分离试剂盒（SEC法）

产品描述

本试剂盒基于分子排阻色谱原理（SEC法），通过分子大小差异实现外泌体分离，具有操作简便、高纯度和高回收率的优点，特别适用于大体积样本的外泌体分离。分离的外泌体可用于 WB 分析、NTA 或纳米流式粒径分析、电镜检测、组学研究及细胞和动物实验中的功能研究。本试剂盒常用于细胞培养上清、尿液等大体积样本，也适用于血清、血浆等样本。

订购信息

产品组分

运输与保存

常温运输。组分A在4℃保存，组分B常温保存，有效期12个月。

使用方法

自备仪器、试剂与耗材：高速冷冻离心机、离心管、超滤管（MWCO：50 kDa）、PBS（现配现用，0.2um 过滤，超声或真空脱气）、20%乙醇（现配现用，0.2um 过滤，超声或真空脱气）、纯化柱固定器(自行购买或者合适的固定试管铁架台，以避免操作过程中发生晃动)

1.      样品预处理

(1）            去除细胞：将样品在 4℃、300g 离心 5 min，转移上清至新离心管；无细胞样本可跳过此步骤。

(2）            去除细胞及碎片：4℃、2,000g 离心 10 min，转移上清至新离心管。

(3）            去除大体积颗粒：步骤 (2)得到的上清，在 4℃、14,000g 下离心 30 min，转移上清至新离心管。

2.      纯化柱预处理

(1)     将外泌体纯化柱（Exosome Purification Column(10mL)）安装在纯化柱固定器上，下方放置废液槽。让纯化柱在室温（18-25℃）平衡至少 30 min；温度过低或过高会影响分离效果。

(2)     检查纯化柱下端是否充满液体，如无空气可跳过此步骤；若有空气，将纯化柱倒置，打开下端密封帽，用移液器或注射器注入水或 20% 乙醇顶出空气，使密封帽中充满液体后重新盖上，并放回固定器。

(3)     打开纯化柱顶盖，再打开下端密封帽，弃去封柱液（可倒掉或用移液器吸出），将纯化柱适配器（Column Adapter (10 mL)）连接到纯化柱，从顶部加入 2 倍柱体积（20 mL）PBS 进行平衡，至下端无溶液流出。清洗过程中确保顶部筛板始终保持湿润。完成后，盖上底端密封帽，断开适配器，并加入 1 mL PBS 备用。

注：

①      每次操作前应先打开纯化柱上盖，再打开下端密封帽，以避免空气进入，影响分离效果。

②      分离过程中确保纯化柱顶部筛板始终湿润，以保持分离效果。

③      向纯化柱中加入大体积溶液时，可将适配器连接到纯化柱，将溶液加入到适配器中。

④      PBS 建议新鲜配制并通过 0.2 μm 滤膜过滤，或使用商业的无菌 PBS 以防微生物或颗粒污染。PBS使用前必须平衡至室温，以避免纯化柱中出现气泡影响分离效果。

3.      分离外泌体

(1)     样品上样：移除纯化柱中的 PBS，在上方加入 1 mL 样本；如样本不足 1 mL，可用 PBS 补至 1 mL，混匀后上样。取下纯化柱底部密封帽，待样本全部进入纯化柱后再加 PBS。

注：

①      如样本体积超过 1 mL，建议用 50 kDa 超滤管将样本浓缩至 1 mL，浓缩倍数不超过 20 倍（具体操作见超滤管使用说明书）。

②      对于高粘度样本（如血浆、血清、高粘度胸腹水等），可取 0.5 mL 样本用 PBS 稀释至 1 mL，混匀后上样。

③      待样品进入筛板后再加入 PBS，以避免样品被稀释影响分离效果。

(2)     外泌体分离：在纯化柱下方放置 1.5 mL 离心管，向上方加入 0.5 mL PBS，待下方收集到 0.5 mL 馏分后，继续加入 0.5 mL PBS，并更换新的 1.5 mL 离心管收集。按流出顺序标记各馏分管编号。

(3)     外泌体收集：收集 4、5、6、7、8 号馏分管以获得外泌体，其中 5、6、7 号馏分管的外泌体浓度更高。可直接对收集液测定外泌体颗粒数和蛋白浓度。

(4)     外泌体浓缩：测定外泌体颗粒浓度和蛋白浓度后，根据后续实验需求，可选择是否进行浓缩。如需浓缩，建议使用 MWCO 50 kDa 的超滤管，在 4,000g 离心至所需体积即可。

4.      纯化柱维护

(1)     收集所有馏分后，将适配器连接至纯化柱，从顶部加入至少 2 倍柱体积（20 mL）PBS清洗纯化柱，至下方无溶液流出。

(2)     继续加入 1.5 倍柱体积（15 mL）20% 乙醇清洗，至下方无溶液流出。

(3)     最后，取下适配器，向纯化柱中加入 3 mL 20% 乙醇封闭液，安装纯化柱顶盖，并在密封帽中填满 20% 乙醇，盖到纯化柱下端出口，于 4℃直立保存。

注意事项

1． 本产品科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2．  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3．  新购买或使用后的纯化柱，上筛板和白色琼脂糖微球之间可能会出现一定的空隙，这是储存和使用过程中凝胶沉降造成的，并不影响纯化柱的性能，将上筛板向下推至无空隙即可正常使用。

4．  本试剂盒常用于细胞培养上清、尿液等大体积样本，也适用于血清、血浆等样本。其他微量珍贵样本，请向本公司技术人员咨询。

5．  纯化柱保存在封闭液中，封闭液为 20%乙醇。20%乙醇建议现配现用，同时经 0.2um 滤膜过滤、超声或真空脱气，避免造成纯化柱出现大量气泡，影响分离效果。

6．  每次纯化柱使用前需要使用无菌并平衡至室温的 PBS 清洗。PBS建议现配现用，同时经 0.2um 滤膜过滤、超声或真空脱气，避免造成纯化柱出现大量气泡，影响分离效果。

7．  纯化柱中间不能有气泡，使用前后需认真检查，避免影响实验。

8．  纯化柱可以反复利用，但是多次使用会影响效果，建议重复使用不超过5次。

9．  当分离的外泌体进行 NGS 或者其他组学分析时，为避免交叉污染，建议每个样品使用一支新的纯化柱。