PEI转染手册

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    PEI转染手册

转染操作流程：
 
  1、细胞传代：

转染前24h内分离293T细胞至含10％胎牛血清的DMEM培养基 中进行传代培养，接种密度如下：
         6孔板：0.5x10⁶细胞
         10cm培养皿：4.0x106细胞
         15cm培养皿：9.0x106细胞

2、转染

转染前将所有试剂置于室温。

2.1质粒DNA的稀释

在无菌试管中，用无血清的DMEM W / O酚红培养基（浓度为10％）稀释质粒DNA（ug）。病毒包装体（psPAX2）：病毒包膜（pMD2G）和重组质粒DNA的稀释比例分别为4:2:1。
       

6孔板：200ul+3ug的DNA
        10cm培养皿：1ml+7-8ug的DNA
        15cm培养皿：2ml+11-12ug的DNA

   2.2 转染复合体形成

将PEI（1ug/uL）加入已稀释的总DNA中，PEI与DNA（ug）的混合比率为3:1。加入后立即涡旋混合。
      

 6孔板：9ul PEI复合体（1ug/ul）=9ug
        10cm培养皿：21ul PEI复合体（1ug/ul）=21ug
        15cm培养皿：33ul PEI复合体（1ug/ul）=33ug
将添加到细胞的DNA/ PEI的混合物在室温下孵育15分钟。

4、收获转染细胞

转染后48小时内收获转染细胞/或病毒上清。
 
试剂的配制：
PEI（1ug/ul） Polysciences（CAT＃23966-2配制成储液：)
1、将无内毒素的无菌水加热至80℃左右溶解PEI，冷却到室温。
2、调整pH值至7.0，用0.22um的滤器过滤消毒，分装后储存在-20℃。工作液可保持在4℃

订货信息

友情提醒：
Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) 23966-2为Polysciences公司生产的化合物产品，每批产品出厂前都经过严格的检测,保证每批产品都*、稳定且高品质,但由于作为转染试剂使用过程中有很多实验室因素(PH,水纯度,称量的准度,dna纯度…)造成溶解出现问题或者转染效率出现差异,所以厂家只受理该产品纯度，分子量及重量缺失破损等相关投诉，针对极个别客户溶解问题和转染效率问题我们只能友善解决,所以不能保证您能获得满意答复，对于产品应用方法的问题，不作为评价我们售后工作的依据。
如果我们提供的PEI手册都无法解答您的问题,建议您可以多看文献,多调整一下转染条件,找出适合自己细胞的转染方法。如果无暇摸索条件,您也可以直接购买我们EZ Trans细胞转染液,这样免去您很多烦恼,谢谢理解

改进的PEI转染试剂EZ Trans细胞转染液 96孔细胞培养板用量  现实中浓度请调整，MAX请适当调整浓度

改进的PEI转染试剂Sinofection和其他产品的对比

Transfection with Sinofection has been proved to provide higher levels of protein expression in several cell lines than leading competitor’s products. For large-scale production of recombinant proteins, Sinofection is the best choice to achieve the optimum yield. In addition, Sinofection also exhibits high transfection efficiency to ensure successful transfections.

Fig. 1 Protein expression levels by transient transfection using Sinofection and other competitors were compared in 9 cell lines, 6 of which showed superior results transfected by Sinofection （A~F）. Protein expression level was determined by Elisa assay. The transfection by competitor transfection reagents followed the manufacturers’ protocols.

Excellent transfection of both adherent and suspension cells for a broad range of cell lines

Hundreds of recombinant antibodies and proteins have been successfully expressed by transient or stable transfection with Sinofection at various scales, from 0.1ml in a 96-well plate to 50L in a bioreactor. Utilizing EZ Trans细胞转染液 for all scales of transfection application will save the cost of research and production to a great extent.

Striking stability at 37°C

Long-term stability test showed Sinofection remained its activity at 37°C for at least 4 months. Storage at -20°C~RT can maintain stable for at least 6 months. Exceptional stability resulted from rigorous screening and reliable investigation for a long time. Thus the stability of Sinofection can outperform any other transfection reagent.

Fig. 2. Stability test for Sinofection at 4 temperatures during 26 weeks. One recombinant antibody and recombinant VEGF-Fc were tested for expression level by transient transfection with Sinofection stored under different conditions. Expression level was assayed by Elisa.

Easy and fast procedure

Transfection protocol （35-mm dish）:

Preparation of cells

• Adherent cells
  • One day before transfection, plate 0.2–2×106 cells in medium per 35-mm dish. Incubate at 37°C （5% CO2） overnight. The confluency of cells should be 50–80% before transfection.
• Suspension cells
  • Plate 2 ml freshly passaged cells at a density of 5 × 104/ml to 1 × 106/ml in a 35-mm dish. The suspension cells should be in log growth phase at the time of transfection. Incubate cells at 37°C （5% CO2） overnight. The cell number depends on your needs and the cell type to be transfected.

Preparation of EZ Trans细胞转染液&DNA complexes

Dilute DNA with appropriate diluents, such as PBS, NaCl solution, glucose solution, DMEM, medium with or without serum, whichever is isotonic, to a concentration of 20 μg/ml （optimization recommended） and a total volume of 250 μl.

Dilute EZ Trans细胞转染液 of appropriate amount in 250 μl of medium.

Combine the diluted DNA with the diluted Sinofection （total volume = 500 μl）. Mix gently and incubate for 20 minutes at room temperature （solution may appear cloudy）.

Transfection

Add the 500 μl complexes drop-wise to cells and medium. Gently rock the dishes or wells to ensure even distribution.

Incubate cells at 37°C in a CO2 incubator for 18-48 hours （normally high expression is achieved after 72 hours） prior to protein expression assay.

Transfection protocol （flask）:

Transfecting Cells for Protein ExpressionThis protocol is typically used to transfect DNA into 293 EBNA or CHO cells cultured in flasks. Use sterile DNA or filter-sterilize DNA before use （re-quantify your DNA after filtration）.

All amounts are on a per flask basis for 30 ml cultures in a 125 ml shake flask; for other formats, see Table 2. Scaling up or Down Transfections.

Table 2. Scaling up or down transfections with Sinofection. Note: the actual conditions should be optimized by experiments.

1. Pass 293 cells at 0.3 × 105 cells/ml, shake at 175 rpm. After 72 hours, dilute cells to 1.0× 106 cells/ml, shake at 175 rpm. Transfect after 4 hours.
2. Pass CHO cells at 0.3 × 105 cells/ml, shake at 175 rpm. After 48 hours, dilute cells to 1.0× 106 cells/ml, shake at 175 rpm. Transfect after 4 hours.
3. Dilute the required plasmid DNA amount with appropriate diluent, such as PBS with Mg2+, 150mM NaCl, 300mM glucose, DMEM medium with or without serum, whichever is isotonic. Incubate for 5 min at room temperature. Add the required Sinofection volume to the diluted DNA and mix gently to assure a total volume of 1.5~3ml.
4. Incubate the mixture for 10-20 minutes at room temperature to allow complexes to form. Do not incubate for longer than 20 minutes.
5. Slowly add 1.5~3ml of DNA-lipid mixture into the 125ml flask containing cells while slowly swirling the flask.
6. Incubate transfected cell cultures at 37°C, 8% CO2 on an orbital shaker set to 175 rpm for both 293 cells and CHO cells.

Low cytotoxicity

EZ Trans细胞转染液 demonstrates very low cytotoxicity which is tested and verified by in-house WST-8 assay for each lot. The WST-8 assay is based on the colorimetric reduction of water soluble tetrazolium （WST） by mitochondrial dehydrogenase

The absorbance of formazan dye solution is in direct proportion to the number of viable cells. Compared with the prev alent WST-1 method, the sensitivity of WST-8 assay is higher meanwhile the solubility and stability of formazan dye is better.

Fig. 3. Microscopy comparison of HeLa cells and DG44 cells transfected with L2K and Sinofection respectively. Transfections were performed following the manufacturer’s recommendations.

Fig. 4. Cytotoxicity comparison of Sinofection and L2K for 4 cell lines. Transfections were performed following the manufacturer’s recommendations.

 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（*转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。

稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

EZ Trans细胞转染试剂是一种阳离子聚合物（PEI）细胞转染液，是新一代的转染试剂，带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过胞吞作用进入细胞。除了具有阳离子脂质体（如：Lipo2000,3000）的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点。

EZ Trans细胞转染试剂一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”体。其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低.

EZ Trans细胞转染试剂与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（也写作：BPEI, 24765-2）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件情况下，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，转染效率比BPEI高一些。但zui近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率。本公司两种PEI转染液均可提供，您可根据文献选择使用。

几种细胞转染方法（试剂）特点比较表

运输与保存方法

常温运输，4℃保存，保质期12个月。

使用注意事项:

质粒质量：请务必使用高质量转染级无内毒素质粒（推荐使用QIAGEN或者MN公司去内毒素质粒提取试剂盒）。通过 260 nm 光吸收测定 DNA 浓度，260 nm / 280 nm 比值确定 DNA 纯度（比值应该在 1.8~2.0 的范围之内）。如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。

细胞条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保培养基没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。建议使用GIBCO或者78bio公司血清培养细胞。?

使用方法：

瞬时转染方法

1. 接种细胞：转染前一天，用胶原酶消化细胞并计数（不建议用胰酶）。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物： DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据下表所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用2-5 μL 线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管，一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置 10~25 min 以形成DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞：直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后，添加1/2体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果：在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后zui快 7h 即可检测到转入基因的表达。请自行确定检测时间。?

稳定转染方法

1. 接种细胞：转染前一天，用胰酶消化细胞并计数。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，总体积如表 1 所示，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物： DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据表 1 所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用2-5 μL 线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管，一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞：直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后，添加½体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果：在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后zui快 7h 即可检测到转入基因的表达。

5.转染 24 h 后，将细胞传代至新鲜的生长培养基中（将细胞稀释 10 倍以上），在 CO2培养箱中 37℃孵育12小时。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约 1~2 周可筛选到耐药性克隆，在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。?

特别提醒:

1. 对于某些类型的细胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 细胞，在转染前两天铺板可显著提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板，可适当降低铺板密度，以确保转染时细胞的汇合度仍为 70~80%。

2. 对于接触抑制敏感的细胞，可适当降低铺板密度。

3. 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情况下，DNA-PEI复合物仍能转染细胞，但是 DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。我们推荐使用 Opti-MEM ITM 培养基以达到*转染效率。其他的无蛋白培养基则需测试与线性PEI转染试剂的兼容性。

4. 对大多数细胞来而言，每 1 μg DNA 使用 3.0 μLEndoFectinTM 试剂都能获得较高转染效率。使用者也可尝试每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 体积线性PEI转染试剂进行优化。