蛋白酶K溶液使用说明书

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蛋白酶K溶液（20mg/ml）

产品简介

蛋白酶K（Proteinase K），相对分子量约为29.3 kDa, 是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，应用广泛，可用于制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶等实验，蛋白酶K的一般工作浓度是50—100µg /ml。因蛋白酶K在变性剂如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH、温度等因素确定具体的工作浓度。蛋白酶K在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。

蛋白酶K有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染核酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常也加入EDTA（以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至终浓度为2mmol/l，以鳌合Ca2+。

运输和储存

      冰袋运输，-20 ℃保存，可以保存12个月。避免反复冻融。

使用方法

      1. 配制蛋白酶K溶液：一般以20mg/ml浓度配制蛋白酶K溶液。将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml dd水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K*溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

      2. 根据终浓度50—100µg /ml，吸取适量蛋白酶K溶液，到待消化样品中，孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时;理想孵育时间为2小时。推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。

注意事项

           蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的样品处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，能增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。

常用蛋白酶作用位点