Super SYBR Green qPCR Master Mix

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Super SYBR Green qPCR Master Mix

Super SYBR Green qPCR Master Mix是一款用于实时定量PCR的即用型试剂盒。其中Super SYBR Green是一种新型的专门为qPCR和高分辨率溶解曲线分析设计的DNA结合染料，它通过一种“按需求释放”的机制，极大地降低了对PCR扩增抑制性。包含一种化学修饰的热启动Taq DNA多聚酶。这种Taq酶2分钟内可以被*激活，尤其适用于快速PCR反应。此外，这种Taq DNA多聚酶在室温下没有活性，不会对DNA造成污染，性能远远优于市面上抗体修饰的热启动酶。Super SYBR Green的另一个优点是它的安全性。常规的DNA结合染料存在潜在的致突变性。基于这方面考虑，我们研发设计了Super SYBR Green染料，它不能透过细胞膜，因而不能与活细胞的基因组DNA结合，确保了其安全性。然而，其他所有的商业性PCR荧光染料都可以在几分钟内进入细胞，例如SYBR Green I，是一种环境毒性接近溴化乙锭（EB）的诱变剂。

此外，Super SYBR Green qPCR Master Mix还有一个非常突出的优点，即它的PCR产物可以直接用于凝胶电泳检测，不需要额外添加任何核酸染料。试剂盒中的Super SYBR Green可以作为DNA预染的核酸染料，电泳后可以直接用于观察DNA条带。光谱特性：Ex/Em: 500/528nm，常规的凝胶成像系统，不需要做任何调整。

试剂盒组成

使用方法

1.实验参考因素

1）如果使用玻璃毛细管进行反应（Roche LightCycler用户部分实验用到），那么需要在反应体系中额外加入BSA（终浓度 ～0.5 mg/mL）；如果使用透明的塑料毛细管，则不需要添加BSA。

2）溶解曲线分析仪器：Rotor-Gene 6000, ABI 7500 ,HR1™, 384-well LightScanner™, Roche LightCycler 480,Rotor-Gene 6000, ABI 7500 和Roche LightCycler480等仪器都可以用于qPCR和溶解曲线的分析。具体参照仪器生产商的使用说明进行数据的采集和分析操作。

3）ΔR 和 ΔRN：当比较众多qPCR Master Mix产生的荧光信号强度时，需要注意比较的方法。通常ΔR是高于基线水平的荧光增量。一般来说，10 μL 的 1× Super SYBR Green反应体系与50 μL ABI公司的1×PowerSYBR 或Invitrogen公司的1×SYBR Green I相比，可以产生更高的ΔR。ΔRN定义为ΔR除以ROX值。因此高浓度的ROX可以产生更低的ΔRN。当ROX被ABI 7500, iCycler IQ, MJ opticon, MJChromo4, MX3000或MX4000仪器zui大激发时，ΔRN会更小。因此，应用于商业SYBR Green Master Mix的较低浓度的ROX往往会产生更高的ΔRN。

4）预期的动力学曲线：根据对比实验我们发现， Super SYBR Green Master Mix的PCR扩增曲线与SYBR Green I的MasterMix相比，其灵敏度和稳定性更高。由于SYBR 染料对DNA扩增的抑制性影响，基于SYBR染料的Master Mix在PCR达到Ct阈值后通常会延迟扩增5-7个循环数。相比较而言，SuperSYBR Green Master Mix可以使PCR持续扩增至50个循环。

5）Ct值：在相同条件下，使用Super SYBR Green和SYBR Green I进行的qPCR反应，其Ct值相对误差在+1或-1之间。

6）扩增片段长度：为了使SYBR Green qPCR Master Mix的扩增效率达到*，推荐的DNA扩增长度为50-200 bp，如果需要扩增更长的DNA片段，那么需要适当延长PCR的反应时间。

7）凝胶电泳分析PCR扩增产物：当使用Super SYBR Green MasterMix进行PCR扩增反应后，如需进行DNA凝胶电泳分析，只要在PCR反应溶液中加入DNA loading buffer，按常规程序上样，跑电泳，不需要在制胶时额外添加核酸染料。使用254 nm UV激发器、凝胶成像仪，或SYBR Green滤光器可以直接观察凝胶。另外，凝胶也可以用488nm 的激光凝胶扫描仪进行观察。

2.PCR反应体系

每管反应组分如下表所示(供参考)

注：1）cDNA模板：SYBR Green qPCR Master Mix适用于mRNA的定量分析。*步通过逆转录将mRNA转录成cDNA，第二步利用Super SYBR Green kit进行cDNA的定量扩增。为了确保扩增效率，cDNA样品的体积不要超过总反应体积的10%。为了定量转录水平，我们推荐使用no-RT的对照样品，以排除可能的基因组DNA的污染。

注：2）一步法RT-qPCR用于mRNA的定量分析。首先引物设计时要尽量避免形成引物二聚体。我们建议合理优化逆转录酶的使用量和逆转录过程的持续时间。耐热的逆转录酶可以兼容Agilent, Fermentas, Lucigen和Life Technologies等各种仪器。如果可以，设计的引物Tm值尽量在55℃左右，逆转录及后续扩增反应也应在55℃。为了定量转录水平，我们推荐使用no-RT的对照样品，以排除有可能的基因组DNA的污染。

注：3）模板浓度：DNA模板依照不同需求，其反应量也有所不同。推荐的基因组DNA的模板量范围是50 pg-50 ng，推荐的cDNA 的模板量范围是50fg-50pg。

注：4）参照染料ROX：对于某些固定型号的仪器，必须添加ROX才能测定Ct值。ROX的使用浓度可以参照表1（见第4页）。ROX会给熔解曲线分析造成一定的背景干扰。因此，为了避免ROX杂峰干扰，在应用软件的“Passive Reference Dye”中不要选择检测ROX荧光值选项，然后再进行数据的收集与分析。

3.反应程序设置

您可以根据扩增模板的性质和仪器的功能，选择以下三个程序之一进行实验。

A．两步快速扩增法

这个程序适用于大多数引物Tm为60℃的扩增，溶解曲线遵循您所用仪器提供的标准流程执行。

注：5）变性时间：如果扩增片段较短，变性时间可以低于5 s，甚至可以低至0 s。当变性时间设置为“0”时，它仅仅意味着温度增加到96℃，然后没有停留迅速降温。设置时间5 s可以确保DNA较长片段和高GC片段的变性。高性能的仪器会进一步增加扩增子变性的可靠性。

B . 三步扩增法

这个程序适用于扩增温度比退火温度高的实验。例如，如果扩增片段有相对较长的引物，容易产生非特异性的扩增，在更高的温度下进行延伸可以降低非特异性扩增。溶解曲线遵循您所用仪器提供的标准流程执行。

注：6）退火温度：退火温度应根据引物Tm值设定，通常是50 -60℃为佳。不过，引物Tm值（和扩增温度）应该设计尽可能地接近60℃（但仍在50 - 60℃范围内），减少退火和变性温度之间的差距。这样温度增加所需时间更少，进而扩增效率更高。

注：7）扩增温度：扩增温度设定在72℃对于大多数扩增子通常效率更高。然而对于富含AT的扩增片段（> 70%）或含有AT富集补丁的扩增子，60℃延长通常可以获得更好的结果。

C．通用程序

此程序适用于几乎所有qPCR仪器，也适用于使用快速扩增法无法达到较好效果的扩增子。

表1、根据PCR仪种类不同，推荐ROX使用浓度