关于高保真DNA聚合酶的应用领域

 

  高保真DNA聚合酶真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好，普通Taq酶的错配率在10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可降到10-6数量级，大大降低了出错的可能性；它适合对PCR保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等。

 

  高保真DNA聚合酶理化性质，纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个-SH基。通过二个酶分子上的-SH基与Hg2+结合产生二聚体，仍有活性。每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow片段，小片段的分子量为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。

 

  高保真DNA聚合酶保真原理是，高保真Taq酶具有3到5核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性；需要提醒的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还会降解引物，而且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。高保真DNA聚合酶的外切活性会导致PCR反应之后不会加尾，所以如果要进行TA克隆，要先进行PCR产物回收（否则影响加尾），然后回收产物用普通Taq酶72度保温一段时间，从而利用普通Taq酶加尾的活性。具有zui高的保真度和zui强的扩增能力，高保真DNA Polymerase，其保真度是Taq DNA Polymerase的52倍，是Pfu DNA Polymerase的6倍，扩增速度是常规聚合酶的4-150倍。