AB11L234-G418（遗传霉素）

AB11L234-G418（遗传霉素），也称作Geneticin (遗传霉素)、G418、G 418或者G-418，是一种结构类似于庆大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷类抗生素，来源于Micromonospora rhodorangea，常用于筛选表达neo基因的真核或原核多克隆或单克隆细胞。

G418不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。本产品的50mg/ml包装经过过滤除菌，可以直接用于细胞培养。

在细菌、酵母、原生动物、蠕虫、高等植物和哺乳动物中，遗传霉素通过抑制蛋白合成而抑制或杀死细胞。其作用机制为遗传霉素能够与70S和80S核糖体结合，从而阻断肽链延伸，干扰蛋白合成。其抗性基因(主要为neo基因)位于转座子Tn601 (903)或Tn5(来源于细菌)，可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞，使细胞表达抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II)，从而获得对G418的耐药性，用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。

哺乳动物细胞中，当抗性基因neo被整合进真核细胞基因组后 ,编码表达氨基糖苷磷酸转移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II)。此酶通过共价修饰G418的氨基或羟基功能，抑制抗生素-核糖体间的相互作用，从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。进行稳转细胞株筛选实验时，需要建立剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)确定杀死无抗性细胞的zui低有效浓度。

植物细胞中，通过转染携带nptII基因的抗性质粒孵育其抗性。nptII基因也能编码表达氨基糖苷磷酸转移酶，这个酶使得多种抗生素丧失活性，包括 G418，卡那霉素和巴龙霉素。

G 418与新霉素同为氨基糖苷类抗生素，都可被Neo基因产物失活，因此都可以用于筛选携带Neo抗性基因的细胞，新霉素筛选的细胞都可以用G418替代。

订购信息

常温运输。4℃保存，有效期36个月。

技术参数

1.CAS：108321-42-2

2.分子式：C20H40N4O10·2H2SO4  

4.分子量：692.71

5.纯度：~98%
6.结构式：

AB11L234-G418（遗传霉素）使用方法

1.G418储存液的配制(50mg/ml，活性浓度)
（1）活力单位的换算
　　根据此公式进行换算：(1000/A0)×A1=A2，其中A0是G418的活力值(Potency)，因批次而异，具体见瓶子的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
　　比如若所用批次的G418 活力值为：750µg/mg，要配制50mg/ml的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50mg/ml=66.33mg/ml。
　　如果配制10ml的G418储存液(活性浓度，50mg/ml)，则需要称取663.3mg粉末。
（2）除菌和保存
　　根据上述换算得到的实际粉末称重量，加入10ml无菌去离子水使其*溶解。
　　先用5ml无菌去离子水预湿润0.22μm针头式过滤器，除尽水。之后使用此滤器过滤，除菌后分装成单次使用的小量(如1ml)放到-20℃冻存，1年稳定。
【注】：不要对混浊的溶液进行过滤，因为混浊的溶液意味着药物未*溶解，过滤过程中会造成药物损失，降低活性；不建议使用液体培养基，NaCl，磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液；配制G418溶液时，一定要根据相应批次G418标注的活力值(potency)来进行换算，从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
2.建议使用浓度
　　一般来说，刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，并用一个较低浓度的G418维持培养。生长条件，细胞类型和其它的环境因素都可能影响G418的用量，因此第一次使用的实验体系建议通过剂量反应性曲线(dose-response curve or kill curve)，来确定最佳筛选浓度。
　　通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000μg/ml；植物细胞：10-100μg/ml；酵母细胞：500-1000μg/ml。

表1.部分哺乳动物细胞的推荐工作浓度表。

3.遗传霉素剂量反应曲线的建立
　　遗传霉素的有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，确定能够杀死未转染宿主细胞的遗传霉素zui低浓度非常重要，对于初次使用的细胞，一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)，曲线建立时至少应设置6个遗传霉素浓度。遗传霉素处理分裂期的细胞时活性*，因此在添加遗传霉素之前需要先将细胞培养一段时间。
（1）第一天：未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO2培养过夜。
注：对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。
（2）根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定0、50、100、200、400、800、1000μg/ml。
（3）第二天：去除旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度遗传霉素的培养基。每个浓度做三个平行孔。更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。
（4）接下来每3-4 d更换新的含药物培养基。
（5）按照固定的周期(如每2 d)进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数(通常是7-10 d)内能够杀死绝大多数细胞的zui低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。
4.稳定转染细胞株的筛选
（1）细胞转染48h后，将细胞置于含有适当浓度遗传霉素的新鲜培养基中培养，此为处理组。
（2）【注】：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用zui明显。当细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降，所以细胞的密度最好不超过25%。建议同时做一个正常细胞的对照组。转染或感染48 h后，如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞，培养过夜后即可进行遗传霉素筛选。每隔3-4 d更换含有遗传霉素的培养液。

（3）筛选7 d后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。对照组正常细胞应该100%死亡，处理组中存活的细胞为表达neo基因的细胞。根据宿主细胞种类和转染/筛选效率不同，集落的形成可能需要一周或者更多的时间。
（4）克隆形成后，挑取并转移5-10个抗性克隆于35mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7 d。
（5）之后更换正常培养基培养即可。

注意事项

1.本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.用于细胞实验，溶解后，须用一次性针头滤器过滤除菌。

3.本产品不可高压灭菌。

4.G418不要和其它抗生素/抗真菌剂(如青霉素/链霉素)共同使用，因为它们是G418的竞争性抑制剂。其它的抗生素也会产生交叉活性。

5.G418加入培养体系中，未转染的细胞有可能不会被杀死，原因在于药物浓度过低，或者细胞密度过高。另外，快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。对照细胞(未转染)可能在添加抗生素5-7 d后才能被杀死，转染细胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14 d形成。

6.即使加入有效剂量的G418，细胞可能会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2 d后才变得明显。

7.本产品可能对人体有一定的毒害作用，请注意适当防护，以避免直接接触人体或吸入体内。

8.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

9.抗生素不稳定，请在有效期内尽快使用。

10.以上数据均来自公开文献, 李记生物暂未本产品进行独立验证, 仅供参考。

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