Protein A/G琼脂糖凝胶

Protein A/G琼脂糖凝胶通常用于从血清、细胞培养上清或腹水中分离抗体，以及从细胞或组织提取物中分离抗原进行免疫沉淀和免疫共沉淀。蛋白A/G琼脂糖偶联高质量的重组蛋白A/G，它可以结合抗体的IgG结合域,这些结构域可以与许多不同物种的抗体结合，包括小鼠、人、兔、猪、狗和猫。

订购信息

常温运输。4℃保存，有效期24个月。

技术参数

悬浮细胞样品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集细胞，弃上清。

2.用PBS 洗细胞一次，即用 PBS 将细胞团重悬，4℃、500-1000 g、10 min，收集细胞，弃上清。

3.用预冷的IP Lysis/Wash Buffer重悬细胞。每50mg 细胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同时加入PMSF等相应的抑制剂，混匀后置于冰上静置5-20 min（期间混匀几次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min离心收集上清液，置于冰上以备后续实验（或置于-80 ℃长期保存）。

血清样品

一般建议建议用IP Lysis/Wash Buffer稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150 µg/mL，置于冰上备用（或置于-20 ℃长期保存）。

免疫复合物的制备

【注】：样品所需的量和孵育时间均依赖于每个特定的抗体-抗原体系，因而可能需要优化才能得到最大产量。

以下实验方案针对2-10μg 亲和纯化的抗体，根据需要可以按比例放大。

1.在离心管中，将每个样品的细胞裂解液与2-10μg 免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1500μg。

2.用IP Lysis/Wash Buffer将抗体以及制备好的样品稀释至300-500μL。

3.在室温下孵育1-2 h，或4 ℃过夜，以形成免疫复合物。

免疫沉淀

【注】：为保证微球均匀分布，使用前通过反复颠倒或轻微涡旋混匀瓶中微球。

1.将25µLProtein A/G琼脂糖加入1.5 mL 离心管中。

2.向离心管中加入500 µL 预冷PBS，轻柔混匀。

3.然后4℃、1000g离心5min,去除上清。

4.向离心管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1min。4℃、1000g离心5min,去除上清。

5.将抗原样品/抗体混合物加入装有Protein A/G琼脂糖的离心管中，保持混匀室温下孵育1-2 h，或4℃过夜。

6.4℃、1000g离心5min，除去未结合的样品，保存以备分析。

7.向离心管中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，轻柔混匀。4℃、1000g离心5min收集琼脂糖，弃上清。再重复洗两次。

8.向离心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），将样品置于100℃水浴或者金属浴中加热10 min。离心后，保留含有目的抗原的上清。

注意事项

1.本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.请勿高速离心、干燥或冷冻磁珠，这些操作会导致微球聚集而降低结合能力。

3.IP实验中不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到IP Lysis/Wash Buffer的影响，因此，如使用本实验步骤不能获得最佳的实验结果，可自行优化操作细节或者筛选及配制缓冲液进行实验，推荐使用李记生物的相关产品，参照相关产品推荐。

4.琼脂糖使用前应充分振荡均匀。琼脂糖应保存在储存溶液中，防止干燥。

附录：蛋白A/G与不同种类的Ig，s及其亚类的结合强度

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