详细介绍
品牌 | 其他品牌 | 供货周期 | 现货 |
---|---|---|---|
应用领域 | 环保,化工,生物产业,综合 |
产品描述
Evagreen 是一种用于实时定量PCR(qPCR)的DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于SYBR Green I。除了有相似的光谱特性,Evagreen有三个主要特点使它区别于SYBR Green I 。
首先,Evagreen对PCR的抑制性远小于SYBR Green I。因此,使用Evagreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时,Evagreen在实验中可以使用较高的浓度,从而获得远强于SYBR Green I扩增信号。较高浓度的Evagreen也消除了“染料重分布"的缺陷,使Evagreen既可用于多重PCR,也可用于高分辨率(高清晰)熔解曲线分析(HRM)。该分析正被越来越多的用于PCR后的基因分型和异源双链分析。由于SYBR Green I对PCR的抑制性,从而要求其使用浓度必须很低,因此SYBR Green I无法解决由低浓度造成的染料重分布问题,既不能用于多重PCR也不能用于HRM。同时,染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性,因为低熔点的DNA链可能由于这种原因而无法检测到。
第二,Evagreen的稳定性强。在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里,也可以反复冻融。与之相反,SYBR Green I不稳定而且降解后对PCR抑制性更强。
第三,Evagreen降低了细胞膜透性,因而比SYBR Green 1更加安全。独立实验室的测试结果显示,Evagreen既没有诱变性也没有细胞毒性。相反,虽然SYBR Green I本身诱变性很弱,但它在细胞中可能抑制了正常DNA的修复机制,使其有诱变增强作用。考虑到PCR的广泛使用,其安全性应该足够重视。
订购信息
产品名称 | 货号 | 规格 |
Evagreen (20 × in water) | AN19L032 | 1 mL |
Evagreen (20 × in water) | AN19L033 | 5 mL |
产品参数
λabs/λem = 500/530 nm (结合DNA)
λabs = 471 nm (未结合DNA)
运输与保存
蓝冰运输。4℃短期避光保存,有效期12个月;-20℃长期避光保存,有效期24个月。
使用方法
如下建立实验体系:(仅供参考)
名 称 | 体 积 |
10× 的无Mg2+聚合酶缓冲液 | 5 µL |
50 mM MgCl2 | 2.5 µL |
2 mM dNTP | 5 µL |
20×Evagreen | 2.5 µL |
Taq DNA polymerase | 1-5 units |
F, R Primers | 各0.1-0.5 µM |
模板 | 适量 |
dH2O | to a final volume of 50 µL |
实验目的
实时定量PCR检测20× Evagreen
主要试剂
1. Prime
hβ-actin:
forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)
3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)
4. BSA: Sigma(A7030)
5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)
实验方案
1. 配制2× Evagreen Buffer
2× Evagreen Buffer | ||
组分 | 浓度 | 体积(μL) |
1 M Tris HCl pH8.5 | 50 mM | 5 |
500 mM (NH4)2SO4 | 20 mM | 4 |
50 mM MgCl2 | 7 mM | 14 |
50% glycerol | 2.5% | 5 |
DMSO | 10 % | 10 |
20× Evagreen | 2× | 10 |
10 mM dNTPs | 0.4 mM | 4 |
2 % Tween20 | 0.03 % | 1.5 |
1 mg/mL BSA | 22 ug/mL | 2.2 |
H2O | / | 44.3 |
Total volume | / | 100 |
2. 配制 q-PCR反应体系
成分 | 20 μL/体系/管反应 |
10 μM primers | 1 μL |
模板 | 适量 |
HS Taq DNA 酶 (5 U/μL) | 0.2 μL |
2× Evagreen buffer | 10 μL |
H2O | 定容至20 μL |
【注】:① DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。②引物终浓度一般控制在0.1-0.5 μM范围内。
3. 实验分组:标准对照样品孔(阳性对照)、检测样品孔、空白对照孔(阴性对照)共三组,同时进行检测,分别进行三次平行实验。
4. 混匀离心、上机进行荧光定量PCR(仪器为Roche:LC96)。
PCR程序:
温度 | 时间 | |
Step 1 | 95℃ | 2 min |
Step 2 | 95℃ | 5 sec |
Step 3 | 60℃ | 30 sec |
Step 2~3,重复 45个循环 | ||
熔解曲线Tm值 57℃~99℃ |
5. 保存数据,判断样本质量:
A.检测样品与标准品之间的Ct值差
B.检测样品与标准品之间的荧光强度差
检测结果需达到:以上两组检测指标无显著性差异
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
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